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類器官代謝分析儀:微生理系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)皮膚類器官
北京佰司特科技有限責(zé)任公司
類器官代謝分析儀:微生理系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)跨上皮細(xì)胞層電阻和細(xì)胞外酸化率
Skin-on-a-Chip:Transepithelial Electrical Resistance
And Extracellular Acidification Measurements
Through an Automated Air-Liquid Interface
皮膚是人體重要的器官,在保護(hù)人體內(nèi)部器官起著至關(guān)重要的作用。因此,人們進(jìn)行了大量的工作來創(chuàng)建人造表皮模型進(jìn)行體外皮膚毒性試驗(yàn)。這些組織模型被稱為重建人表皮細(xì)胞模型(reconstructed human epidermis,RhE),被用于在制藥、化妝品和環(huán)境領(lǐng)域中評(píng)估皮膚暴露于外源性物質(zhì)中的毒性研究。在這里,我們提出了一個(gè)無標(biāo)記的方法,即利用了intelligent lab for in vitro diagnostics(IMOLA-IVD)一個(gè)無創(chuàng)、基于傳感器的平臺(tái),來檢測(cè)多孔膜上RhE細(xì)胞模型和貼壁細(xì)胞的跨上皮細(xì)胞層電阻(transepithelial electrical resistance,TEER)。首先在聚碳酸酯膜上培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞作為測(cè)試模型,使用定制的生物芯片封閉式設(shè)計(jì),以及雙微流道結(jié)構(gòu),用于培養(yǎng)物的連續(xù)和自動(dòng)灌流。檢測(cè)L929細(xì)胞的胞外酸化率(Extracellular acidification rate,EAR)和跨上皮細(xì)胞層電阻(transepithelia lelectrical resistance,TEER)。通過該平臺(tái)監(jiān)測(cè)RhE細(xì)胞模型的TEER超過48小時(shí)。TEER和EAR測(cè)試表明,該平臺(tái)可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)芯片上的皮膚細(xì)胞模型,監(jiān)測(cè)代謝參數(shù),以及組織降解。
Keywords:TEER;Organ-on-a-Chip;skin models;reconstructed human epidermis;impedance;label-free monitoring
1. INTRODUCTION
作為人體最大的器官,皮膚代表著人體內(nèi)部和外部環(huán)境之間的結(jié)構(gòu)學(xué)屏障,將體內(nèi)器官與毒素、病原體隔離開來,并保護(hù)內(nèi)部器官免受紫外線(UV)輻射。除了重要的屏障功能,人體皮膚還執(zhí)行人體的幾個(gè)基本功能,如熱調(diào)節(jié)、感覺和排泄。因?yàn)槠つw是人類抵御外部環(huán)境的影響的第一防護(hù)罩,新的化學(xué)物質(zhì)的研究,如藥物和毒素,必須分析和評(píng)估其對(duì)調(diào)節(jié)皮膚完整性的能力。調(diào)查在這些化合物的影響下,細(xì)胞生物學(xué)利用細(xì)胞培養(yǎng)模型,更深入的研究了解由化學(xué)物質(zhì)調(diào)節(jié)的細(xì)胞行為。在過去的十年里,科學(xué)家開發(fā)了各種生物工程模型用于皮膚毒性研究。第一個(gè)皮膚模型基于傳統(tǒng)的二維(2D)共培養(yǎng)模型,角質(zhì)細(xì)胞接種到培養(yǎng)好的成纖維細(xì)胞上。由于在剛性塑料上培養(yǎng)不能長(zhǎng)時(shí)間維持上皮細(xì)胞,而且阻止了細(xì)胞分層,組織工程界開發(fā)了3D皮膚模型來再現(xiàn)體內(nèi)類似結(jié)構(gòu),并通過整合氣液界面設(shè)計(jì)了一個(gè)更具有生理相關(guān)性的環(huán)境。
人的皮膚由下列初級(jí)層組成,它們具有附屬的功能:表皮層、真皮層和皮下組織。將不同皮膚層整合到細(xì)胞模型中,目前的皮膚模型可分為含角質(zhì)細(xì)胞的重建人表皮模型、含角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的代表真皮和表皮隔層的全層模型,以及帶有額外細(xì)胞類型(如黑素細(xì)胞、干細(xì)胞等)的全層模型。由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化,重新建立人表皮(RhE)模型具有較高的重現(xiàn)性,因而被廣泛接受。RhE細(xì)胞模型由人源性角質(zhì)細(xì)胞接種在聚碳酸酯半透膜上,并將其納入細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),置于標(biāo)準(zhǔn)孔板中,如商業(yè)化的Transwell®系統(tǒng)(Corning Inc.,Corning,NY,USA)。該裝置將培養(yǎng)物放置在氣液界面,皮膚表面暴露在空氣中,形成生理環(huán)境類似的培養(yǎng)條件。目前,有開放的皮膚模型,以及商業(yè)的模型,如EpiDerm™(MatTek in vitro life science laboratories, Bratislava, Slovak Republic),EpiSkin™(EpiSkin, Lyon Cedex, France),SkinEthic™(EpiSkin),EpiCS®(CellSystemsGmbH,Troisdorf,Germany),和LabCyte(Japan Tissue Engineering Co., Ltd. [J-TEC], Aichi, Japan)。ALEXANDRA協(xié)會(huì)遵循非營(yíng)利性的方法,為制作和測(cè)試開放的3D皮膚模型提供了方案。
2. Background
2.1. 基于重構(gòu)人表皮的皮膚毒性試驗(yàn)的最新進(jìn)展
從監(jiān)管角度來看,評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)有毒化合物和藥物對(duì)皮膚的有害影響,3D模型系統(tǒng)必須經(jīng)過一系列廣泛測(cè)試化合物的驗(yàn)證。如果通過歐洲替代方法驗(yàn)證中心 (ECVAM) 證實(shí)和經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)測(cè)試指南(TG),具有測(cè)試技術(shù)的模型就可以作為可接受的工具用于皮膚毒性測(cè)試。到目前為止,OECD提供了用于皮膚腐蝕和刺激的指南測(cè)試的指南,分別基于OECD TG 431和439。
2.2.器官芯片平臺(tái)和微生理測(cè)量
由于目前的模型在生物學(xué)的相關(guān)性上,只提供有限的意義,所以毒理學(xué)領(lǐng)域測(cè)試正朝著實(shí)現(xiàn)器官芯片(Organ-on-Chip,OOC)儀器的方向發(fā)展。器官芯片系統(tǒng)描述了一種包含灌注小室的微流體細(xì)胞培養(yǎng)裝置,在生理相關(guān)條件下培養(yǎng)活細(xì)胞。然而,大多數(shù)OOC平臺(tái)仍然嚴(yán)重依賴端點(diǎn)分析方法,缺乏的不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)試方法。此外,化學(xué)標(biāo)簽,如熒光標(biāo)簽可能會(huì)潛在地影響細(xì)胞代謝從而改變實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,采用無標(biāo)簽技術(shù)的實(shí)時(shí)讀數(shù)的集成設(shè)備,對(duì)于測(cè)量進(jìn)行空間和時(shí)間解析的是非常有意義的。
2.3. 皮膚/重建人表皮的跨上皮細(xì)胞層電阻
由于潛在的有害化合物會(huì)影響皮膚厚度,厚度的測(cè)量也是早期研究的參數(shù)之一。破壞性測(cè)量,例如活組織檢查,或非破壞性測(cè)量,如共焦拉曼光譜儀和超聲波成像。其中傳統(tǒng)的方法和有用的細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用就是測(cè)量皮膚通透性屏障,以評(píng)估上皮或內(nèi)皮組織的活力和功能。在這里,跨上皮細(xì)胞層電阻(TEER)提供了一種無標(biāo)記和快速的技術(shù)來研究皮膚完整性。TEER值代表了一層或幾層細(xì)胞層的電阻值。
2.4. 目前跨上皮細(xì)胞層電阻測(cè)量的缺點(diǎn)和跨上皮細(xì)胞層電阻自動(dòng)化測(cè)量的需要
除了微加工方法,還有一些商業(yè)上可用的外部測(cè)試系統(tǒng),如“伏特-歐姆計(jì)”(World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA),,它可以現(xiàn)成的。由于缺少與細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的整合,研究人員需要手動(dòng)將細(xì)胞培養(yǎng)物從生物培養(yǎng)箱放到測(cè)量系統(tǒng)。這個(gè)過程缺乏重現(xiàn)性和標(biāo)準(zhǔn)化,也不能提供高通量測(cè)量的能力。雖然下一代的電極室(如Endohm室)可以直接測(cè)量,但是培養(yǎng)基以及試劑都必須手動(dòng)加入,用于長(zhǎng)期培養(yǎng)和藥物研究案例。因此,擴(kuò)展的研究是不可能的,因?yàn)榕f的介質(zhì)不能從培養(yǎng)系統(tǒng)中取出,也沒有自動(dòng)灌注新鮮的培養(yǎng)基??偠灾?,目前的TEER測(cè)量系統(tǒng)仍然嚴(yán)重依賴手動(dòng)操作和手持式系統(tǒng),影響了測(cè)量的穩(wěn)定性,從而影響了整體實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)認(rèn)為,一個(gè)可接受的測(cè)試方案,分析重現(xiàn)性是驗(yàn)證中的一個(gè)基本標(biāo)準(zhǔn)。因此,TEER領(lǐng)域通過集成自動(dòng)TEER監(jiān)控和采集,系統(tǒng)能夠在培養(yǎng)基頻繁變化的情況下執(zhí)行編程模式測(cè)量,也非常有意義。
在此,我們介紹了一種新的自動(dòng)監(jiān)測(cè)測(cè)試和采集數(shù)據(jù)的微生理測(cè)量系統(tǒng)(IMOLA-IVD,德國(guó)cellasys)用于TEER測(cè)量。通過一個(gè)密封設(shè)計(jì)的商業(yè)化,用聚碳酸酯膜培養(yǎng)的表皮細(xì)胞RhE細(xì)胞模型。應(yīng)用TEER測(cè)量用于研究RhE培養(yǎng),并集成到自動(dòng)化的流體平臺(tái),可以精確灌注培養(yǎng)基和加藥。此外,我們能夠監(jiān)測(cè)細(xì)胞外酸化率(extracellular acidification rate, EAR)。實(shí)證研究的目的是通過集成自動(dòng)化灌流系統(tǒng)和集成測(cè)試平臺(tái),實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)測(cè)量,同時(shí)保證測(cè)量穩(wěn)定性。本研究演示了一種評(píng)估皮膚完整性的無創(chuàng)的測(cè)量方法的驗(yàn)證和應(yīng)用。
3.Materials and Methods
3.1. 體外診斷智能移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室概述
IMOLA-IVD是一種芯片上的實(shí)驗(yàn)室測(cè)量系統(tǒng),用于自動(dòng)監(jiān)測(cè)L929小鼠成纖維細(xì)胞和EpiDerm™重建人表皮細(xì)胞模型的TEER和EAR。IMOLA-IVD的基本操作已經(jīng)在之前的工作中進(jìn)行了描述,簡(jiǎn)單地說,每個(gè)IMOLA-IVD包括一個(gè)電源、模擬和數(shù)字模塊,以及一個(gè)集成了傳感器的生物芯片,該傳感器被動(dòng)地監(jiān)測(cè)細(xì)胞模型的微環(huán)境。標(biāo)準(zhǔn)的IMOLA-IVD實(shí)驗(yàn)是通過裝載數(shù)據(jù)采集和鏈接應(yīng)用DALiA 2.0軟件的個(gè)人計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的,以控制一個(gè)蠕動(dòng)泵和連接6個(gè)IMOLA-IVD系統(tǒng)的微流控通路。泵在ON和OFF狀態(tài)之間循環(huán)。在OFF泵關(guān)閉周期,細(xì)胞能夠代謝培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);在ON泵打開周期,營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基被灌流到細(xì)胞中。
3.2 改進(jìn)的BioChip-D小室
生物芯片模塊包含一個(gè)傳感器芯片連接到電路板并連接到一個(gè)圓柱形密封小室,用以保護(hù)芯片的連接并連通細(xì)胞及培養(yǎng)基。一個(gè)流體頭直接連接密封小室,形成一個(gè)液體密封、靜態(tài)微容積(~ 6μL)的反應(yīng)室,在集成的傳感器表面測(cè)量細(xì)胞外酸化率(EAR)和氧合作用 (圖1a)。然而,需要測(cè)量RhE的情況下,多孔膜上培養(yǎng)的細(xì)胞不適合標(biāo)準(zhǔn)生物芯片或標(biāo)準(zhǔn)的IMOLA-IVD叉指電極傳感器(IDES)測(cè)量電阻。為了克服這些限制,新的密封小室和流體頭的設(shè)計(jì),以保持空氣-液體使用Pro/Engineer Wildfire 4.0 (PTC Inc., Needham, MA, USA)。密封用Ultimaker 2 (Ultimaker BV,Geldermalsen,Netherlands),使用聚乳酸(PLA)和硅橡膠醫(yī)用粘合劑(Corning Inc., New York, NY, USA)連接到生物芯片BioChip。重新設(shè)計(jì)的BioChip小室適用于擴(kuò)大培養(yǎng)室和其他多孔膜上培養(yǎng)的細(xì)胞(圖1b)的RhE。
3.3. L929細(xì)胞與重建人表皮細(xì)胞的制備與培養(yǎng)
記錄小鼠成纖維細(xì)胞(L929)和重建人表皮細(xì)胞(RhE)的跨上皮細(xì)胞層電阻值。L929細(xì)胞在加10%胎牛血清(FBS) 和10 μg/ml gentamycin (Thermo Fisher,Waltham, MA, USA)。細(xì)胞按照標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范(GLP)培養(yǎng),并保存于37℃和5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后,在95%融合度時(shí),細(xì)胞傳代,100,000細(xì)胞種在12mm Transwell®上,孔徑3 μm的多孔膜(Corning Inc.)。transwell隨后被放置在6孔板上,并在1ml DMEM中再孵育24小時(shí),然后轉(zhuǎn)移到modified BioChip中。L929細(xì)胞是我們實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系,用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
將EpiDerm™RhE細(xì)胞模型轉(zhuǎn)移到6孔板上,并在5.5mm/5mL的MatTek無血清長(zhǎng)期培養(yǎng)基(#EPI-100-NMM-250) (MatTek in vitro life science laboratories)。每48小時(shí)交換一次培養(yǎng)基,直到轉(zhuǎn)移到BioChips中TEER實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始前24 h,將培養(yǎng)基減少到0.9 mL然后放在12孔板里。Modified BioChip-D在70%乙醇中室溫滅菌處理20 min后,用無菌去離子水沖洗。生物芯片灌流無緩沖DMEM處理24 h以穩(wěn)定溫度,然后將膜培養(yǎng)物放置在芯片上。
3.4. 自動(dòng)化灌流系統(tǒng)的介紹
設(shè)計(jì)了一種自動(dòng)灌流系統(tǒng)來自動(dòng)化監(jiān)測(cè)在生物芯片上培養(yǎng)48小時(shí)以上的RhE細(xì)胞模型的TEER。該系統(tǒng)由兩個(gè)流體模塊(FM)組成,通過與Tygon® E-3603 (ProLiquid GmbH, Ueberlingen, Germany)管道連接成獨(dú)立的管道。這些獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò)通過IMOLA-IVD泵標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的ON/OFF開關(guān)程序,向基底細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)豐富的細(xì)胞培養(yǎng)基,并定期向Transwell®膜的頂部區(qū)域,泵入磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)。如圖2所示。培養(yǎng)基流入模塊在無緩沖的DMEM和0.2%SDS的培養(yǎng)基之間切換,提供給膜底部的細(xì)胞。TEER測(cè)量模塊連接到PBS進(jìn)行TEER測(cè)量或測(cè)試可用于接種RhE表面的水溶性測(cè)試物。
L929細(xì)胞培養(yǎng)在多孔膜小室上,RhE細(xì)胞模型培養(yǎng)在Modified BioChip-D上,通過無緩沖的DMEM與灌流泵進(jìn)行36小時(shí)周期的培養(yǎng)。對(duì)于L929細(xì)胞,為監(jiān)測(cè)細(xì)胞酸化,泵ON時(shí)間為5分鐘,而泵OFF時(shí)間為5分鐘、10分鐘、30分鐘和55分鐘。對(duì)于RhE細(xì)胞模型,泵周期為5分鐘ON, 10分鐘OFF, 5分鐘ON, 25分鐘OFF, 5分鐘ON, 10分鐘OFF。在25分鐘的泵OFF階段,通過將PBS泵入膜頂部小室,在芯片上的電阻傳感器和流體頭部的導(dǎo)線電極之間建立電路連接,記錄TEER測(cè)量。以60 μL/min的速度將750 μL的PBS泵到芯片上的膜上,然后以120μL/min的速度去除。TEER測(cè)量是在25分鐘泵關(guān)閉期間進(jìn)行的。在預(yù)定的穩(wěn)定測(cè)量周期后(L929細(xì)胞和RhE細(xì)胞模型分別為47和36小時(shí)),將0.2% SDS無緩沖DMEM泵入芯片作為陽(yáng)性對(duì)照。用SDS培養(yǎng)基灌注至少12小時(shí),以證實(shí)對(duì)照組對(duì)測(cè)得的TEER的影響。
4. Results and Discussion
4.1. 重新設(shè)計(jì)的經(jīng)上皮電阻密封功能
將多孔膜插入培養(yǎng)室,確定培養(yǎng)室體積為~170 μL。匹配樣機(jī)通過膜下形成的入口孔灌注到腔內(nèi),膜底部的孔允許新鮮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被動(dòng)地?cái)U(kuò)散到細(xì)胞的基底層和細(xì)胞的廢物擴(kuò)散出細(xì)胞。在泵ON循環(huán)期間,營(yíng)養(yǎng)消耗后的培養(yǎng)基泵出腔室(圖2)。RhE培養(yǎng)物的頂端表面暴露于環(huán)境空氣中,經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng),刺激分化成一個(gè)ALI的分層。為了測(cè)量這些培養(yǎng)物的TEER,重新設(shè)計(jì)的流體頭包含一個(gè)雙向的入口/出口閥,周期性地分配一定量的PBS溶液。這種方法連接多孔膜頂端腔的導(dǎo)線電極(見圖1b)和傳感器芯片上的平面IDES電極之間的電路。溢流閥使TEER電極淹沒在穩(wěn)定的培養(yǎng)基體積中,防止溢流。連續(xù)5分鐘記錄膜的TEER,然后在測(cè)量之后取出PBS以維持ALI。
4.2. 小鼠成纖維細(xì)胞的胞外酸化率的測(cè)定
使用自動(dòng)測(cè)量程序?qū)崟r(shí)測(cè)量EAR,將L929細(xì)胞生長(zhǎng)在聚碳酸酯膜。用未緩沖的DMEM以50 μL/min的速率灌注L929細(xì)胞。圖3顯示了在泵交替階段測(cè)量的pH值(以mV為單位)。紅色條表示泵OFF階段,灌流新鮮培養(yǎng)基,細(xì)胞活躍地將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝為酸性廢物,生物芯片上的金屬氧化物傳感器會(huì)檢測(cè)到這些代謝物。綠色條表示泵ON階段。在此階段中,膜底部灌注新鮮培養(yǎng)基,提供營(yíng)養(yǎng)給膜上培養(yǎng)的細(xì)胞。從圖中可以看出,當(dāng)培養(yǎng)基酸化時(shí),泵OFF階段55分鐘內(nèi),電壓會(huì)增加~5 mV,而較短的時(shí)間內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生明顯的電壓變化。
4.3. 小鼠成纖維細(xì)胞對(duì)十二烷基硫酸鈉培養(yǎng)基的代謝反應(yīng)
一旦泵ON周期結(jié)束,測(cè)量的電壓迅速下降,直到達(dá)到基線(穩(wěn)態(tài))值。在下降之前存在一個(gè)短暫的延遲,這可能是由于新鮮培養(yǎng)基與芯片上已有的酸化培養(yǎng)基之間的混合導(dǎo)致的,因?yàn)槌隹诘奈恢酶哂谶M(jìn)口。在58小時(shí),測(cè)量的信號(hào)下降。這可能是由于細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)基中。在56小時(shí),細(xì)胞已經(jīng)溶解,因此不會(huì)產(chǎn)生廢物酸化周圍的介質(zhì),導(dǎo)致在55分鐘泵OFF階段信號(hào)變平坦。圖4描述了在實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間55分鐘OFF階段持續(xù)測(cè)量EAR。可以看出,加入SDS后,EAR突增,然后迅速降至零以下,表明細(xì)胞裂解。然后它逐漸趨近于零,直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
4.4. 小鼠成纖維細(xì)胞的TEER(跨上皮細(xì)胞層電阻)監(jiān)測(cè)
除了監(jiān)測(cè)L929細(xì)胞的代謝率,在25分鐘泵OFF期間還可以監(jiān)測(cè)TEER值。在TEER測(cè)量過程中,隨著PBS泵入測(cè)量小室以連接電路進(jìn)行測(cè)量,數(shù)值會(huì)發(fā)生變化。TEER開始無數(shù)值,因?yàn)?/span>電極對(duì)之間存在斷路。嵌入在流體頭的導(dǎo)線電極浸入PBS中,與膜下的芯片上的導(dǎo)電電極一起連接形成電路。PBS在細(xì)胞上停留5分鐘,泵OFF以進(jìn)行穩(wěn)定監(jiān)測(cè)。然后PBS被泵出測(cè)量小室,直到下一個(gè)測(cè)量循環(huán)。
圖4顯示了從25小時(shí)開始測(cè)量的EAR和TEER。在泵OFF階段,EAR由線性回歸計(jì)算。表1總結(jié)了SDS加入前和加入后的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)開始24小時(shí)后,實(shí)測(cè)的實(shí)數(shù)電阻穩(wěn)定在190歐姆附近,虛部電阻為-40歐姆。因?yàn)橐阎狶929小鼠成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)中保持單層,預(yù)計(jì)電阻將穩(wěn)定在一個(gè)低水平。暴露于0.2% SDS培養(yǎng)基8小時(shí)后(時(shí)間為第 56小時(shí)),實(shí)數(shù)電阻下降14.8%,對(duì)應(yīng)加入SDS導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。虛部電阻下降6.11%。這些結(jié)果表明,開發(fā)的密封設(shè)計(jì)和泵模塊能夠進(jìn)行自動(dòng)化電阻測(cè)量。
4.4. RhE細(xì)胞模型的TEER(跨上皮細(xì)胞層電阻)監(jiān)測(cè)
使用上述相同的設(shè)置對(duì)重建人表皮細(xì)胞模型(reconstructed human epidermis,RhE)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)TEER約50小時(shí)。在前12小時(shí),TEER值保持相對(duì)穩(wěn)定,如圖5所示。在36小時(shí)后,用0.2% SDS處理細(xì)胞后2小時(shí),平均TEER值突然下降。(b)SDS培養(yǎng)基加入前,TEER值最初是直線增加的,在用PBS加入頂端腔后,然后迅速穩(wěn)定并保持,直到5分鐘的測(cè)量周期結(jié)束。當(dāng)從上部小室中移除培養(yǎng)基后,由于電路短路,TEER再次變成無數(shù)值。
在換到SDS培養(yǎng)基2小時(shí)后,TEER曲線的變化就可以被檢測(cè)到。起初,TEER值與加入SDS培養(yǎng)基前相同。但是TEER值在測(cè)量期間穩(wěn)步下降,直到穩(wěn)定在一個(gè)更低的值。這導(dǎo)致測(cè)得的平均TEER降低,這與加入SDS引起的細(xì)胞裂解吻合。此外,隨著SDS培養(yǎng)基加入時(shí)間的增加,電阻的初始峰幅值減小。盡管暴露于SDS,最初的峰值的持續(xù)似乎表明細(xì)胞存活。值得注意的是,以前的IMOLA-IVD研究是在簡(jiǎn)單的單層細(xì)胞上進(jìn)行的,相對(duì)較低濃度的0.2% SDS就可以較短的時(shí)間內(nèi)殺死細(xì)胞。而更加嚴(yán)重細(xì)胞裂解過程相對(duì)緩慢可能歸因于更復(fù)雜的3D皮膚模型中培養(yǎng)的細(xì)胞的生命力的增強(qiáng)。
5. Conclusions
在這里,我們提出了一種創(chuàng)新的方法,以非侵入性監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)在二維和三維多孔膜在各種形態(tài)。我們的生物芯片密封設(shè)計(jì)被證明支持小鼠成纖維細(xì)胞的單層,以及更復(fù)雜的重建人表皮細(xì)胞模型(reconstructed human epidermis,RhE)。此外,設(shè)計(jì)了一個(gè)兩部分的自動(dòng)化流體系統(tǒng),處理將PBS溶液輸送和加入到頂部腔室進(jìn)行TEER測(cè)量。使用L929細(xì)胞,設(shè)計(jì)了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的操作方法,通過定期測(cè)量TEER來監(jiān)測(cè)代謝率和屏障完整性。SDS培養(yǎng)基加入之前保持的細(xì)胞活力,作為陽(yáng)性對(duì)照。
在用L929細(xì)胞進(jìn)行初步試驗(yàn)后,對(duì)重建人表皮細(xì)胞模型的TEER進(jìn)行監(jiān)測(cè)。TEER值顯示皮膚模型可以培養(yǎng)至少24小時(shí),加入SDS培養(yǎng)基后的細(xì)胞裂解也會(huì)延遲。在以后的實(shí)驗(yàn)中可以使用更高的SDS濃度來提高對(duì)照的響應(yīng)時(shí)間??偟膩碚f,這項(xiàng)工作是一項(xiàng)概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),證明了IMOLA-IVD用于復(fù)雜3D組織模型的能力,作為非侵入式自動(dòng)化細(xì)胞分析的工具。