類器官代謝分析儀：微生理系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)跨上皮細(xì)胞層電阻和細(xì)胞外酸化率

Skin-on-a-Chip：Transepithelial Electrical Resistance

And Extracellular Acidification Measurements

Through an Automated Air-Liquid Interface

皮膚是人體重要的器官，在保護(hù)人體內(nèi)部器官起著至關(guān)重要的作用。因此，人們進(jìn)行了大量的工作來創(chuàng)建人造表皮模型進(jìn)行體外皮膚毒性試驗(yàn)。這些組織模型被稱為重建人表皮細(xì)胞模型（reconstructed human epidermis，RhE），被用于在制藥、化妝品和環(huán)境領(lǐng)域中評(píng)估皮膚暴露于外源性物質(zhì)中的毒性研究。在這里，我們提出了一個(gè)無標(biāo)記的方法，即利用了intelligent lab for in vitro diagnostics（IMOLA-IVD）一個(gè)無創(chuàng)、基于傳感器的平臺(tái)，來檢測(cè)多孔膜上RhE細(xì)胞模型和貼壁細(xì)胞的跨上皮細(xì)胞層電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）。首先在聚碳酸酯膜上培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞作為測(cè)試模型，使用定制的生物芯片封閉式設(shè)計(jì)，以及雙微流道結(jié)構(gòu)，用于培養(yǎng)物的連續(xù)和自動(dòng)灌流。檢測(cè)L929細(xì)胞的胞外酸化率（Extracellular acidification rate，EAR）和跨上皮細(xì)胞層電阻（transepithelia lelectrical resistance，TEER）。通過該平臺(tái)監(jiān)測(cè)RhE細(xì)胞模型的TEER超過48小時(shí)。TEER和EAR測(cè)試表明，該平臺(tái)可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)芯片上的皮膚細(xì)胞模型，監(jiān)測(cè)代謝參數(shù)，以及組織降解。        

Keywords：TEER；Organ-on-a-Chip；skin models；reconstructed human epidermis；impedance；label-free monitoring

1.       INTRODUCTION

作為人體最大的器官，皮膚代表著人體內(nèi)部和外部環(huán)境之間的結(jié)構(gòu)學(xué)屏障，將體內(nèi)器官與毒素、病原體隔離開來，并保護(hù)內(nèi)部器官免受紫外線（UV）輻射。除了重要的屏障功能，人體皮膚還執(zhí)行人體的幾個(gè)基本功能，如熱調(diào)節(jié)、感覺和排泄。因?yàn)槠つw是人類抵御外部環(huán)境的影響的第一防護(hù)罩，新的化學(xué)物質(zhì)的研究，如藥物和毒素，必須分析和評(píng)估其對(duì)調(diào)節(jié)皮膚完整性的能力。調(diào)查在這些化合物的影響下，細(xì)胞生物學(xué)利用細(xì)胞培養(yǎng)模型，更深入的研究了解由化學(xué)物質(zhì)調(diào)節(jié)的細(xì)胞行為。在過去的十年里，科學(xué)家開發(fā)了各種生物工程模型用于皮膚毒性研究。第一個(gè)皮膚模型基于傳統(tǒng)的二維（2D）共培養(yǎng)模型，角質(zhì)細(xì)胞接種到培養(yǎng)好的成纖維細(xì)胞上。由于在剛性塑料上培養(yǎng)不能長(zhǎng)時(shí)間維持上皮細(xì)胞，而且阻止了細(xì)胞分層，組織工程界開發(fā)了3D皮膚模型來再現(xiàn)體內(nèi)類似結(jié)構(gòu)，并通過整合氣液界面設(shè)計(jì)了一個(gè)更具有生理相關(guān)性的環(huán)境。

人的皮膚由下列初級(jí)層組成，它們具有附屬的功能：表皮層、真皮層和皮下組織。將不同皮膚層整合到細(xì)胞模型中，目前的皮膚模型可分為含角質(zhì)細(xì)胞的重建人表皮模型、含角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的代表真皮和表皮隔層的全層模型，以及帶有額外細(xì)胞類型（如黑素細(xì)胞、干細(xì)胞等）的全層模型。由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化，重新建立人表皮（RhE）模型具有較高的重現(xiàn)性，因而被廣泛接受。RhE細(xì)胞模型由人源性角質(zhì)細(xì)胞接種在聚碳酸酯半透膜上，并將其納入細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，置于標(biāo)準(zhǔn)孔板中，如商業(yè)化的Transwell®系統(tǒng)（Corning Inc.，Corning，NY，USA）。該裝置將培養(yǎng)物放置在氣液界面，皮膚表面暴露在空氣中，形成生理環(huán)境類似的培養(yǎng)條件。目前，有開放的皮膚模型，以及商業(yè)的模型，如EpiDerm™（MatTek in vitro life science laboratories, Bratislava, Slovak Republic），EpiSkin™（EpiSkin, Lyon Cedex, France），SkinEthic™（EpiSkin），EpiCS®（CellSystemsGmbH，Troisdorf，Germany），和LabCyte（Japan Tissue Engineering Co., Ltd. [J-TEC], Aichi, Japan）。ALEXANDRA協(xié)會(huì)遵循非營(yíng)利性的方法，為制作和測(cè)試開放的3D皮膚模型提供了方案。

2. Background

2.1. 基于重構(gòu)人表皮的皮膚毒性試驗(yàn)的最新進(jìn)展

從監(jiān)管角度來看，評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)有毒化合物和藥物對(duì)皮膚的有害影響，3D模型系統(tǒng)必須經(jīng)過一系列廣泛測(cè)試化合物的驗(yàn)證。如果通過歐洲替代方法驗(yàn)證中心 （ECVAM） 證實(shí)和經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）測(cè)試指南（TG），具有測(cè)試技術(shù)的模型就可以作為可接受的工具用于皮膚毒性測(cè)試。到目前為止，OECD提供了用于皮膚腐蝕和刺激的指南測(cè)試的指南，分別基于OECD TG 431和439。

2.2.器官芯片平臺(tái)和微生理測(cè)量

由于目前的模型在生物學(xué)的相關(guān)性上，只提供有限的意義，所以毒理學(xué)領(lǐng)域測(cè)試正朝著實(shí)現(xiàn)器官芯片（Organ-on-Chip，OOC）儀器的方向發(fā)展。器官芯片系統(tǒng)描述了一種包含灌注小室的微流體細(xì)胞培養(yǎng)裝置，在生理相關(guān)條件下培養(yǎng)活細(xì)胞。然而，大多數(shù)OOC平臺(tái)仍然嚴(yán)重依賴端點(diǎn)分析方法，缺乏的不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)試方法。此外，化學(xué)標(biāo)簽，如熒光標(biāo)簽可能會(huì)潛在地影響細(xì)胞代謝從而改變實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，采用無標(biāo)簽技術(shù)的實(shí)時(shí)讀數(shù)的集成設(shè)備，對(duì)于測(cè)量進(jìn)行空間和時(shí)間解析的是非常有意義的。

２.３. 皮膚/重建人表皮的跨上皮細(xì)胞層電阻

由于潛在的有害化合物會(huì)影響皮膚厚度，厚度的測(cè)量也是早期研究的參數(shù)之一。破壞性測(cè)量，例如活組織檢查，或非破壞性測(cè)量，如共焦拉曼光譜儀和超聲波成像。其中傳統(tǒng)的方法和有用的細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用就是測(cè)量皮膚通透性屏障，以評(píng)估上皮或內(nèi)皮組織的活力和功能。在這里，跨上皮細(xì)胞層電阻（TEER）提供了一種無標(biāo)記和快速的技術(shù)來研究皮膚完整性。TEER值代表了一層或幾層細(xì)胞層的電阻值。

２.４. 目前跨上皮細(xì)胞層電阻測(cè)量的缺點(diǎn)和跨上皮細(xì)胞層電阻自動(dòng)化測(cè)量的需要

除了微加工方法，還有一些商業(yè)上可用的外部測(cè)試系統(tǒng)，如“伏特-歐姆計(jì)”（World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA）,，它可以現(xiàn)成的。由于缺少與細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的整合，研究人員需要手動(dòng)將細(xì)胞培養(yǎng)物從生物培養(yǎng)箱放到測(cè)量系統(tǒng)。這個(gè)過程缺乏重現(xiàn)性和標(biāo)準(zhǔn)化，也不能提供高通量測(cè)量的能力。雖然下一代的電極室（如Endohm室）可以直接測(cè)量，但是培養(yǎng)基以及試劑都必須手動(dòng)加入，用于長(zhǎng)期培養(yǎng)和藥物研究案例。因此，擴(kuò)展的研究是不可能的，因?yàn)榕f的介質(zhì)不能從培養(yǎng)系統(tǒng)中取出，也沒有自動(dòng)灌注新鮮的培養(yǎng)基?？偠灾?，目前的TEER測(cè)量系統(tǒng)仍然嚴(yán)重依賴手動(dòng)操作和手持式系統(tǒng)，影響了測(cè)量的穩(wěn)定性，從而影響了整體實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）認(rèn)為，一個(gè)可接受的測(cè)試方案，分析重現(xiàn)性是驗(yàn)證中的一個(gè)基本標(biāo)準(zhǔn)。因此，TEER領(lǐng)域通過集成自動(dòng)TEER監(jiān)控和采集，系統(tǒng)能夠在培養(yǎng)基頻繁變化的情況下執(zhí)行編程模式測(cè)量，也非常有意義。

在此，我們介紹了一種新的自動(dòng)監(jiān)測(cè)測(cè)試和采集數(shù)據(jù)的微生理測(cè)量系統(tǒng)（IMOLA-IVD，德國(guó)cellasys）用于TEER測(cè)量。通過一個(gè)密封設(shè)計(jì)的商業(yè)化，用聚碳酸酯膜培養(yǎng)的表皮細(xì)胞RhE細(xì)胞模型。應(yīng)用TEER測(cè)量用于研究RhE培養(yǎng)，并集成到自動(dòng)化的流體平臺(tái)，可以精確灌注培養(yǎng)基和加藥。此外，我們能夠監(jiān)測(cè)細(xì)胞外酸化率（extracellular acidification rate， EAR）。實(shí)證研究的目的是通過集成自動(dòng)化灌流系統(tǒng)和集成測(cè)試平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)測(cè)量，同時(shí)保證測(cè)量穩(wěn)定性。本研究演示了一種評(píng)估皮膚完整性的無創(chuàng)的測(cè)量方法的驗(yàn)證和應(yīng)用。

3．Materials and Methods

3.1. 體外診斷智能移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室概述  

IMOLA-IVD是一種芯片上的實(shí)驗(yàn)室測(cè)量系統(tǒng)，用于自動(dòng)監(jiān)測(cè)L929小鼠成纖維細(xì)胞和EpiDerm™重建人表皮細(xì)胞模型的TEER和EAR。IMOLA-IVD的基本操作已經(jīng)在之前的工作中進(jìn)行了描述，簡(jiǎn)單地說，每個(gè)IMOLA-IVD包括一個(gè)電源、模擬和數(shù)字模塊，以及一個(gè)集成了傳感器的生物芯片，該傳感器被動(dòng)地監(jiān)測(cè)細(xì)胞模型的微環(huán)境。標(biāo)準(zhǔn)的IMOLA-IVD實(shí)驗(yàn)是通過裝載數(shù)據(jù)采集和鏈接應(yīng)用DALiA 2.0軟件的個(gè)人計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的，以控制一個(gè)蠕動(dòng)泵和連接6個(gè)IMOLA-IVD系統(tǒng)的微流控通路。泵在ON和OFF狀態(tài)之間循環(huán)。在OFF泵關(guān)閉周期，細(xì)胞能夠代謝培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；在ON泵打開周期，營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基被灌流到細(xì)胞中。

3.2 改進(jìn)的BioChip-D小室

生物芯片模塊包含一個(gè)傳感器芯片連接到電路板并連接到一個(gè)圓柱形密封小室，用以保護(hù)芯片的連接并連通細(xì)胞及培養(yǎng)基。一個(gè)流體頭直接連接密封小室，形成一個(gè)液體密封、靜態(tài)微容積（~ 6μL）的反應(yīng)室，在集成的傳感器表面測(cè)量細(xì)胞外酸化率（EAR）和氧合作用 （圖1a）。然而，需要測(cè)量RhE的情況下，多孔膜上培養(yǎng)的細(xì)胞不適合標(biāo)準(zhǔn)生物芯片或標(biāo)準(zhǔn)的IMOLA-IVD叉指電極傳感器（IDES）測(cè)量電阻。為了克服這些限制，新的密封小室和流體頭的設(shè)計(jì)，以保持空氣-液體使用Pro/Engineer Wildfire 4.0 （PTC Inc., Needham, MA, USA）。密封用Ultimaker 2 （Ultimaker BV，Geldermalsen，Netherlands），使用聚乳酸（PLA）和硅橡膠醫(yī)用粘合劑（Corning Inc., New York, NY, USA）連接到生物芯片BioChip。重新設(shè)計(jì)的BioChip小室適用于擴(kuò)大培養(yǎng)室和其他多孔膜上培養(yǎng)的細(xì)胞（圖1b）的RhE。

3.3. L929細(xì)胞與重建人表皮細(xì)胞的制備與培養(yǎng)

記錄小鼠成纖維細(xì)胞（L929）和重建人表皮細(xì)胞（RhE）的跨上皮細(xì)胞層電阻值。L929細(xì)胞在加10%胎牛血清（FBS） 和10 μg/ml gentamycin （Thermo Fisher,Waltham, MA, USA）。細(xì)胞按照標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范（GLP）培養(yǎng)，并保存于37℃和5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，在95%融合度時(shí)，細(xì)胞傳代，100,000細(xì)胞種在12mm Transwell®上，孔徑3 μm的多孔膜（Corning Inc.）。transwell隨后被放置在6孔板上，并在1ml DMEM中再孵育24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到modified BioChip中。L929細(xì)胞是我們實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

將EpiDerm™RhE細(xì)胞模型轉(zhuǎn)移到6孔板上，并在5.5mm/5mL的MatTek無血清長(zhǎng)期培養(yǎng)基（#EPI-100-NMM-250） （MatTek in vitro life science laboratories）。每48小時(shí)交換一次培養(yǎng)基，直到轉(zhuǎn)移到BioChips中TEER實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始前24 h，將培養(yǎng)基減少到0.9 mL然后放在12孔板里。Modified BioChip-D在70%乙醇中室溫滅菌處理20 min后，用無菌去離子水沖洗。生物芯片灌流無緩沖DMEM處理24 h以穩(wěn)定溫度，然后將膜培養(yǎng)物放置在芯片上。

3.4. 自動(dòng)化灌流系統(tǒng)的介紹

設(shè)計(jì)了一種自動(dòng)灌流系統(tǒng)來自動(dòng)化監(jiān)測(cè)在生物芯片上培養(yǎng)48小時(shí)以上的RhE細(xì)胞模型的TEER。該系統(tǒng)由兩個(gè)流體模塊（FM）組成，通過與Tygon® E-3603 （ProLiquid GmbH, Ueberlingen, Germany）管道連接成獨(dú)立的管道。這些獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò)通過IMOLA-IVD泵標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的ON/OFF開關(guān)程序，向基底細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)豐富的細(xì)胞培養(yǎng)基，并定期向Transwell®膜的頂部區(qū)域，泵入磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）。如圖2所示。培養(yǎng)基流入模塊在無緩沖的DMEM和0.2%SDS的培養(yǎng)基之間切換，提供給膜底部的細(xì)胞。TEER測(cè)量模塊連接到PBS進(jìn)行TEER測(cè)量或測(cè)試可用于接種RhE表面的水溶性測(cè)試物。

L929細(xì)胞培養(yǎng)在多孔膜小室上，RhE細(xì)胞模型培養(yǎng)在Modified BioChip-D上，通過無緩沖的DMEM與灌流泵進(jìn)行36小時(shí)周期的培養(yǎng)。對(duì)于L929細(xì)胞，為監(jiān)測(cè)細(xì)胞酸化，泵ON時(shí)間為5分鐘，而泵OFF時(shí)間為5分鐘、10分鐘、30分鐘和55分鐘。對(duì)于RhE細(xì)胞模型，泵周期為5分鐘ON, 10分鐘OFF, 5分鐘ON, 25分鐘OFF, 5分鐘ON, 10分鐘OFF。在25分鐘的泵OFF階段，通過將PBS泵入膜頂部小室，在芯片上的電阻傳感器和流體頭部的導(dǎo)線電極之間建立電路連接，記錄TEER測(cè)量。以60 μL/min的速度將750 μL的PBS泵到芯片上的膜上，然后以120μL/min的速度去除。TEER測(cè)量是在25分鐘泵關(guān)閉期間進(jìn)行的。在預(yù)定的穩(wěn)定測(cè)量周期后（L929細(xì)胞和RhE細(xì)胞模型分別為47和36小時(shí)），將0.2% SDS無緩沖DMEM泵入芯片作為陽(yáng)性對(duì)照。用SDS培養(yǎng)基灌注至少12小時(shí)，以證實(shí)對(duì)照組對(duì)測(cè)得的TEER的影響。

4. Results and Discussion

4.1. 重新設(shè)計(jì)的經(jīng)上皮電阻密封功能

將多孔膜插入培養(yǎng)室，確定培養(yǎng)室體積為~170 μL。匹配樣機(jī)通過膜下形成的入口孔灌注到腔內(nèi)，膜底部的孔允許新鮮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被動(dòng)地?cái)U(kuò)散到細(xì)胞的基底層和細(xì)胞的廢物擴(kuò)散出細(xì)胞。在泵ON循環(huán)期間，營(yíng)養(yǎng)消耗后的培養(yǎng)基泵出腔室（圖2）。RhE培養(yǎng)物的頂端表面暴露于環(huán)境空氣中，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，刺激分化成一個(gè)ALI的分層。為了測(cè)量這些培養(yǎng)物的TEER，重新設(shè)計(jì)的流體頭包含一個(gè)雙向的入口/出口閥，周期性地分配一定量的PBS溶液。這種方法連接多孔膜頂端腔的導(dǎo)線電極（見圖1b）和傳感器芯片上的平面IDES電極之間的電路。溢流閥使TEER電極淹沒在穩(wěn)定的培養(yǎng)基體積中，防止溢流。連續(xù)5分鐘記錄膜的TEER，然后在測(cè)量之后取出PBS以維持ALI。

4.2. 小鼠成纖維細(xì)胞的胞外酸化率的測(cè)定

使用自動(dòng)測(cè)量程序?qū)崟r(shí)測(cè)量EAR，將L929細(xì)胞生長(zhǎng)在聚碳酸酯膜。用未緩沖的DMEM以50 μL/min的速率灌注L929細(xì)胞。圖3顯示了在泵交替階段測(cè)量的pH值（以mV為單位）。紅色條表示泵OFF階段，灌流新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞活躍地將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝為酸性廢物，生物芯片上的金屬氧化物傳感器會(huì)檢測(cè)到這些代謝物。綠色條表示泵ON階段。在此階段中，膜底部灌注新鮮培養(yǎng)基，提供營(yíng)養(yǎng)給膜上培養(yǎng)的細(xì)胞。從圖中可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基酸化時(shí)，泵OFF階段55分鐘內(nèi)，電壓會(huì)增加~5 mV，而較短的時(shí)間內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生明顯的電壓變化。

4.3. 小鼠成纖維細(xì)胞對(duì)十二烷基硫酸鈉培養(yǎng)基的代謝反應(yīng)

一旦泵ON周期結(jié)束，測(cè)量的電壓迅速下降，直到達(dá)到基線（穩(wěn)態(tài)）值。在下降之前存在一個(gè)短暫的延遲，這可能是由于新鮮培養(yǎng)基與芯片上已有的酸化培養(yǎng)基之間的混合導(dǎo)致的，因?yàn)槌隹诘奈恢酶哂谶M(jìn)口。在58小時(shí)，測(cè)量的信號(hào)下降。這可能是由于細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)基中。在56小時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)溶解，因此不會(huì)產(chǎn)生廢物酸化周圍的介質(zhì)，導(dǎo)致在55分鐘泵OFF階段信號(hào)變平坦。圖4描述了在實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間55分鐘OFF階段持續(xù)測(cè)量EAR。可以看出，加入SDS后，EAR突增，然后迅速降至零以下，表明細(xì)胞裂解。然后它逐漸趨近于零，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

4.4. 小鼠成纖維細(xì)胞的TEER（跨上皮細(xì)胞層電阻）監(jiān)測(cè)

除了監(jiān)測(cè)L929細(xì)胞的代謝率，在25分鐘泵OFF期間還可以監(jiān)測(cè)TEER值。在TEER測(cè)量過程中，隨著PBS泵入測(cè)量小室以連接電路進(jìn)行測(cè)量，數(shù)值會(huì)發(fā)生變化。TEER開始無數(shù)值，因?yàn)?/span>電極對(duì)之間存在斷路。嵌入在流體頭的導(dǎo)線電極浸入PBS中，與膜下的芯片上的導(dǎo)電電極一起連接形成電路。PBS在細(xì)胞上停留5分鐘，泵OFF以進(jìn)行穩(wěn)定監(jiān)測(cè)。然后PBS被泵出測(cè)量小室，直到下一個(gè)測(cè)量循環(huán)。

圖4顯示了從25小時(shí)開始測(cè)量的EAR和TEER。在泵OFF階段，EAR由線性回歸計(jì)算。表1總結(jié)了SDS加入前和加入后的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)開始24小時(shí)后，實(shí)測(cè)的實(shí)數(shù)電阻穩(wěn)定在190歐姆附近，虛部電阻為-40歐姆。因?yàn)橐阎狶929小鼠成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)中保持單層，預(yù)計(jì)電阻將穩(wěn)定在一個(gè)低水平。暴露于0.2% SDS培養(yǎng)基8小時(shí)后（時(shí)間為第 56小時(shí)），實(shí)數(shù)電阻下降14.8%，對(duì)應(yīng)加入SDS導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。虛部電阻下降6.11%。這些結(jié)果表明，開發(fā)的密封設(shè)計(jì)和泵模塊能夠進(jìn)行自動(dòng)化電阻測(cè)量。

4.4. RhE細(xì)胞模型的TEER（跨上皮細(xì)胞層電阻）監(jiān)測(cè)

使用上述相同的設(shè)置對(duì)重建人表皮細(xì)胞模型（reconstructed human epidermis，RhE）進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)TEER約50小時(shí)。在前12小時(shí)，TEER值保持相對(duì)穩(wěn)定，如圖5所示。在36小時(shí)后，用0.2% SDS處理細(xì)胞后2小時(shí)，平均TEER值突然下降。（b）SDS培養(yǎng)基加入前，TEER值最初是直線增加的，在用PBS加入頂端腔后，然后迅速穩(wěn)定并保持，直到5分鐘的測(cè)量周期結(jié)束。當(dāng)從上部小室中移除培養(yǎng)基后，由于電路短路，TEER再次變成無數(shù)值。

在換到SDS培養(yǎng)基2小時(shí)后，TEER曲線的變化就可以被檢測(cè)到。起初，TEER值與加入SDS培養(yǎng)基前相同。但是TEER值在測(cè)量期間穩(wěn)步下降，直到穩(wěn)定在一個(gè)更低的值。這導(dǎo)致測(cè)得的平均TEER降低，這與加入SDS引起的細(xì)胞裂解吻合。此外，隨著SDS培養(yǎng)基加入時(shí)間的增加，電阻的初始峰幅值減小。盡管暴露于SDS，最初的峰值的持續(xù)似乎表明細(xì)胞存活。值得注意的是，以前的IMOLA-IVD研究是在簡(jiǎn)單的單層細(xì)胞上進(jìn)行的，相對(duì)較低濃度的0.2% SDS就可以較短的時(shí)間內(nèi)殺死細(xì)胞。而更加嚴(yán)重細(xì)胞裂解過程相對(duì)緩慢可能歸因于更復(fù)雜的3D皮膚模型中培養(yǎng)的細(xì)胞的生命力的增強(qiáng)。

5. Conclusions

在這里，我們提出了一種創(chuàng)新的方法，以非侵入性監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)在二維和三維多孔膜在各種形態(tài)。我們的生物芯片密封設(shè)計(jì)被證明支持小鼠成纖維細(xì)胞的單層，以及更復(fù)雜的重建人表皮細(xì)胞模型（reconstructed human epidermis，RhE）。此外，設(shè)計(jì)了一個(gè)兩部分的自動(dòng)化流體系統(tǒng)，處理將PBS溶液輸送和加入到頂部腔室進(jìn)行TEER測(cè)量。使用L929細(xì)胞，設(shè)計(jì)了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的操作方法，通過定期測(cè)量TEER來監(jiān)測(cè)代謝率和屏障完整性。SDS培養(yǎng)基加入之前保持的細(xì)胞活力，作為陽(yáng)性對(duì)照。

在用L929細(xì)胞進(jìn)行初步試驗(yàn)后，對(duì)重建人表皮細(xì)胞模型的TEER進(jìn)行監(jiān)測(cè)。TEER值顯示皮膚模型可以培養(yǎng)至少24小時(shí)，加入SDS培養(yǎng)基后的細(xì)胞裂解也會(huì)延遲。在以后的實(shí)驗(yàn)中可以使用更高的SDS濃度來提高對(duì)照的響應(yīng)時(shí)間?？偟膩碚f，這項(xiàng)工作是一項(xiàng)概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證明了IMOLA-IVD用于復(fù)雜3D組織模型的能力，作為非侵入式自動(dòng)化細(xì)胞分析的工具。